【珍藏版】Nat RevGenetics丨亓磊/W.E.Moerner/朱彥宇:從“基因剪刀”到“分子顯微鏡”，CRISPR開啟活細胞4D基因組動力學觀測新紀元

導讀

三維基因組的結(jié)構(gòu)與動態(tài)變化，對于維持基因組穩(wěn)定性、調(diào)控基因復制與轉(zhuǎn)錄、執(zhí)行細胞功能乃至疾病的發(fā)生都至關(guān)重要。傳統(tǒng)的基因組研究多依賴于“靜態(tài)快照”，而近年來興起的CRISPR活細胞成像技術(shù)，正讓科學家們能夠在活細胞中“實時直播”基因組的三維動態(tài)，開啟了觀測生命“第四維度” ——時間的全新篇章。

近日，斯坦福大學亓磊教授與2014年諾貝爾化學獎得主W.E. Moerner教授的深度跨學科合作，朱彥宇博士領銜完成，在Nature Reviews Genetics發(fā)表一篇題為CRISPR-Cas-based live cell imaging of genome dynamics的綜述。該綜述系統(tǒng)闡述了CRISPR技術(shù)如何從“基因剪刀”革命性地化身為“分子顯微鏡”，全面梳理了基于CRISPR的活細胞DNA和RNA成像領域的技術(shù)發(fā)展歷程，并深入探討了這些前沿技術(shù)如何推動我們對染色質(zhì)運動、轉(zhuǎn)錄調(diào)控和疾病機制的理解。文章全面梳理了從工具開發(fā)、實驗設計到數(shù)據(jù)分析的全流程，堪稱三維基因組領域研究者的“百科全書式”的指南。

從“靜態(tài)照片”到“實時電影”：觀測基因組的第四維度

人類基因組，將展開后線性長度達2 米的DNA分子壓縮折疊至微米級的細胞核內(nèi)。這種精妙的三維折疊，形成了區(qū)室、拓撲關(guān)聯(lián)域（TADs）和染色質(zhì)環(huán)等復雜結(jié)構(gòu)，它們的動態(tài)變化和相互作用，精密地調(diào)控著基因表達、細胞特性乃至疾病的發(fā)生。癌癥、神經(jīng)系統(tǒng)疾病、發(fā)育異常等許多疾病的發(fā)病機制，往往與三維基因組結(jié)構(gòu)異常有關(guān)。然而，現(xiàn)有認知多來自間接的固定細胞檢測技術(shù)，比如傳統(tǒng)的FISH和Hi-C技術(shù)，其雖然能提供高分辨率的“靜態(tài)快照”，卻無法捕捉其動態(tài)過程，如同繪制了一幅精美的靜態(tài)“建筑圖”，卻無法告訴我們細胞這座“城市”的實時交通——染色質(zhì)的動態(tài)行為。而基因轉(zhuǎn)錄、DNA損傷修復、細胞分化等核心生命過程，本質(zhì)上都是動態(tài)的。要破解這些“生命暗碼”，我們必須引入第四個維度——時間。

早期的活細胞成像技術(shù)（如LacO/TetO系統(tǒng)）需要在基因組中插入巨大的人工序列，這個過程不僅耗時復雜，而且可能干擾內(nèi)源染色質(zhì)的天然結(jié)構(gòu)與功能。CRISPR技術(shù)的出現(xiàn)徹底改變了這一局面。它不僅是一種強大的基因編輯技術(shù)，更可通過巧妙的改造，引入熒光標記，化身為一臺可編程的“分子GPS”。其核心原理是：利用亓磊教授發(fā)明的核酸酶失活的Cas9蛋白dCas9（nuclease-dead Cas9）與序列特異性的單向?qū)NA（sgRNA）相結(jié)合，在不切割DNA的情況下，將熒光標記精確靶向內(nèi)源基因組位點。

2013年，亓磊和黃波實驗室合作將綠色熒光蛋白（EGFP）與dCas9蛋白融合， 成功實現(xiàn)了對端粒和MUC4基因內(nèi)含子中的重復序列的活細胞成像。這項開創(chuàng)性工作證明了CRISPR成像的可行性。這一可編程熒光標記系統(tǒng)，為活細胞中特定位點染色質(zhì)的實時成像提供了的平臺，從而實現(xiàn)了從靜態(tài)描述到動態(tài)觀測的革命性飛躍。

CRISPR成像工具箱的發(fā)展

最初的CRISPR DNA成像面臨信噪比 (Signal-to-Noise Ratio，SNR) 過低的核心挑戰(zhàn)，尤其在觀測非重復序列時。由于單個熒光蛋白信號微弱，易被大量游離熒光分子的背景噪音淹沒，因此早期方法多靶向重復序列。重復序列能“天然放大”信號：其多個靶點可被同一種sgRNA識別，從而聚集熒光分子，形成可觀測的“光斑”。然而，增強子、啟動子等關(guān)鍵調(diào)控元件多為非重復序列。為攻克此難題，在過去的十二年中，領域內(nèi)發(fā)展出多種創(chuàng)新策略。本綜述即從提升信噪比、實現(xiàn)多色成像、擴展觀測目標（從重復到非重復序列，從DNA到RNA）等維度，梳理其中的關(guān)鍵進展。

（一）重復基因組序列的成像

1.提升信噪比——增強信號和降低背景

提升信噪比最直接的思路就是增強目標信號。策略包括：直接在dCas9上融合多個熒光蛋白；另一種是以CRISPR-SunTag為代表的招募系統(tǒng)，通過在dCas9上融合多個GCN4多肽標簽，來招募大量熒光抗體片段（single-chain variable fragments ，scFv），從而實現(xiàn)信號的數(shù)十倍放大。

提升SNR的另一個策略是降低背景。比如CRISPR-LIBR利用光誘導系統(tǒng)，將細胞核中未結(jié)合的熒光復合物轉(zhuǎn)移到細胞質(zhì)。或如ArrayG/N和fCRISPR等技術(shù)，探針僅在結(jié)合到目標位點時才被點亮。

2.多色和多模態(tài)成像

要理解不同基因位點（如增強子與啟動子）的協(xié)同作用，就必須同時觀測多個目標。

一種方法是利用來自不同物種的正交dCas系統(tǒng)（如dSpCas9, dSaCas9）融合不同顏色的熒光蛋白，但此法受限于可用系統(tǒng)的數(shù)量。另一類方法是改造sgRNA二級結(jié)構(gòu)，利用其上融合的核酸適配體（Aptamer）招募熒光標記的結(jié)合蛋白。如Thoru Pederson實驗室開發(fā)的CRISPRainbow利用多種正交適配體（如MS2, PP7, boxB）招募不同顏色的熒光蛋白。這種設計產(chǎn)生了一個具有三種原色（通過組合原色得到三種次級顏色）的CRISPR復合物組合文庫，實現(xiàn)“光譜編碼”，從而實現(xiàn)了對六個不同重復區(qū)域的成像。后續(xù)的優(yōu)化技術(shù)，如CRISPR-Sirius和CRISPR-16xMS2-MCP，通過增加適配體拷貝數(shù)，進一步增強信號，甚至實現(xiàn)了對低重復及非重復區(qū)域的成像。這種直接將顏色信息“編織”進sgRNA的設計，極大地擴展了CRISPR成像的應用。

此外，為同步觀察DNA、RNA和蛋白質(zhì)，CRISPR-Tag和TriTag等技術(shù)可同時標記基因位點并追蹤其轉(zhuǎn)錄和翻譯產(chǎn)物，揭示基因調(diào)控全景。

3.利用合成有機染料的CRISPR成像方法

相比于熒光蛋白，有機染料分子更小、亮度更高、光穩(wěn)定性更好（其在光淬滅前通常能發(fā)射約10?個光子，而熒光蛋白僅為約10?個）。但需要精巧的化學偶聯(lián)策略將其精確地“安裝”到CRISPR系統(tǒng)上。主要策略包括：

1. HaloTag系統(tǒng)： 利用dCas9融合的HaloTag酶與帶染料的配體發(fā)生共價結(jié)合，實現(xiàn)標記。

2. 熒光發(fā)生適體（Fluorogenic Aptamer）： sgRNA與熒光發(fā)生RNA適體（如Broccoli適體）融合，這些適體能結(jié)合并增強基特定小分子（比如DFHBI）的熒光。

3. Molecular Beacon（CRISPR-MB）：CRISPR-MB技術(shù)利用一個發(fā)夾狀的Molecular Beacon。其在游離時熒光被“淬滅”，只有與sgRNA上的靶序列結(jié)合后，才打開結(jié)構(gòu)并增強熒光。

4. 熒光發(fā)生CRISPR（fCRISPR）： 系統(tǒng)中的熒光蛋白由于存在降解域（degron domain）而不穩(wěn)定。只有熒光蛋白通過與靶向的Pepper aptamer sgRNA結(jié)合時，才能免于降解并發(fā)光，從而降低的背景。

5. LiveFISH（live-cell FISH）： 通過在體外預先組裝dCas9與熒光染料標記的RNA形成熒光核糖核蛋白（fluorescent ribonucleoproteins, fRNPs），再將其遞送到細胞內(nèi)，實現(xiàn)了高度的靈活性和通用性，并已成功應用于原代細胞。但由于信噪比的限制，第一代LiveFISH僅適用于對重復基因組區(qū)域進行成像。

（二）非重復序列的成像挑戰(zhàn)

絕大多數(shù)基因及基因組調(diào)控元件如增強子、啟動子都屬于非重復序列。對非重復序列成像極具挑戰(zhàn)，因其缺乏重復序列的天然信號放大效應。單個基因座只能招募少量熒光復合物，其微弱信號易被背景噪音淹沒。為此，研究人員主要采用兩種優(yōu)化策略：增強單個探針的信號，或增加靶向同一區(qū)域的sgRNA數(shù)量。

1 基于少量sgRNA的信號放大

該策略通過分子工程，最大化單個成像復合物的熒光信號，在簡化遞送的同時提高信噪比。比如CRISPR-16xMS2-MCP通過在sgRNA上整合多個MS2適配體來招募更多熒光蛋白。CRISPR-FISHer利用蛋白三聚化誘導熒光蛋白在靶點發(fā)生相分離以富集熒光蛋白。CRISPR-QD利用高量子產(chǎn)率和高光穩(wěn)定性的量子點（quantum dots ，QD）作為熒光基團。CRISPR-dual-FRET通過CRISPR–MB與F?rster resonance energy transfer (FRET) 相結(jié)合，利用FRET發(fā)生的鄰近效應抑制背景。CRISPR-Casilio利用PUF RNA-結(jié)合域，為多色成像提供“編碼空間”。SIMBA系統(tǒng)利用SunTag和HP1α的相互作用，實現(xiàn)信號放大并兼具基因操控功能。SNP-CLING 利用 dCas9 的PAM識別特異性，實現(xiàn)單核苷酸精度的等位基因特異標記。

2. 使用大量sgRNA“平鋪”目標區(qū)域：

該策略通過使用大量覆蓋目標區(qū)域的sgRNA，以數(shù)量累積的方式將多個微弱信號疊加成可檢測的光斑。

DNA載體共遞送： 早期通過慢病毒或多質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染實現(xiàn)，效率和均一性差。后續(xù)通過層級克隆將多個sgRNA整合入單一載體（如多盒串聯(lián)組裝策略和CARGO）或利用Cas12a自我加工CRISPR陣列（CRISPRdelight）簡化遞送流程和提高效率。

體外組裝與遞送: 該策略繞過了細胞內(nèi)轉(zhuǎn)錄翻譯過程。CAS-LiveFISH直接遞送熒光dCas9蛋白與體外轉(zhuǎn)錄（IVT）的sgRNA。而亓磊實驗室開發(fā)的Oligo-LiveFISH則更進一步，直接使用化學合成并預先標記好熒光染料的sgRNA寡核苷酸池。該方法具有極高的通用性，成功應用于原代細胞等難轉(zhuǎn)染細胞，并與超高分辨率顯微鏡結(jié)合，實現(xiàn)了納米級時空分辨率的基因組追蹤。

（三）RNA成像

為關(guān)聯(lián)染色質(zhì)動態(tài)與基因表達，需同步成像RNA。CRISPR系統(tǒng)利用改造的RCas9（需PAMmer引導）或天然RNA靶向蛋白dCas13，實現(xiàn)了內(nèi)源RNA的活細胞追蹤。dCas9（靶向DNA）和dCas13（靶向RNA）的正交組合，更可在同一細胞內(nèi)對DNA與RNA進行同步多色成像，為解析基因調(diào)控提供了可能。

實驗參數(shù)考量

成功的CRISPR活細胞成像依賴于對多個關(guān)鍵參數(shù)的綜合優(yōu)化。

1. 圖像質(zhì)量 : 圖像質(zhì)量是所有分析的基礎，信噪比（SNR）是其金標準。高SNR能提升定位精度。文章澄清了領域內(nèi)長期存在的將SNR與信號背景比（Signal-to-Background Ratio，SBR）、信號背景噪聲比（Signal-to-Background-Noise Ratio, SBN) 等概念混淆，指出SNR是評價成像質(zhì)量的根本指標。文章指出了一個常被忽略的要點：噪聲不僅來自背景，也來自信號本身（泊松噪聲），一個嚴謹?shù)腟NR計算必須考慮所有噪聲源。

2. 探針設計與遞送: 探針和遞送策略從源頭決定實驗成敗。gRNA效率主要取決于探針數(shù)量和染色質(zhì)可及性。在遞送策略上，體外預組裝RNP并遞送的方法（如Oligo-LiveFISH）相比構(gòu)建穩(wěn)定細胞系，具有更高的靈活性和更廣的應用范圍，尤其在原代細胞等難處理體系中優(yōu)勢顯著。

3. 多重性與特異性: 為了實現(xiàn)多色成像，直接標記sgRNA比使用有限的正交Cas系統(tǒng)更具優(yōu)勢。同時，特異性是CRISPR成像的關(guān)鍵考量，需通過FISH等方法對脫靶效應等進行嚴格驗證。

4. 顯微鏡選擇: 文章對比了多種DNA活細胞成像平臺：寬場 (Wide-field) 顯微鏡易于操作，但是背景高且缺乏Z軸信息；共聚焦顯微鏡能有效去除焦外光，其中轉(zhuǎn)盤式共聚焦 (Spinning disk confocal microscopy) 速度更快，適合活細胞成像；光片（ Light-sheet）顯微鏡光毒性極低，適合厚樣本成像。此外還有將分辨率提升到~100 nm的Structured illumination microscopy (SIM)以及納米精度的MINFLUX。

傳統(tǒng)光學顯微鏡的空間分辨率受限于衍射極限（diffraction limit ，~250納米）。然而，基因位點這樣的稀疏分布的發(fā)光體的成像可近似為一個由點擴散函數(shù)（PSF）決定的光斑。通過將其測量強度分布擬合為合適的函數(shù)（如二維高斯函數(shù)），在收集到足夠光子數(shù)的情況下可將定位精度提升至10-20納米，顯著小于衍射極限。這種方法被稱為超定位（super-localization）顯微技術(shù)。

傳統(tǒng)的二維成像技術(shù)在研究三維的生命活動時存在局限。將三維空間分布投影到二維平面會丟失關(guān)鍵的空間和動態(tài)信息。三維超定位顯微鏡，比如Moerner組開發(fā)的雙螺旋點擴散函數(shù)（Double-Helix Point Spread Function，DHPSF）顯微鏡，通過工程化PSF來編碼軸向信息，實現(xiàn)高精度的三維動態(tài)追蹤。

實驗的時間分辨率必須與所研究的生物過程的時間尺度相匹配。這需要在空間分辨率、時間分辨率和成像總時長之間做出權(quán)衡，以在保證信噪比的同時，最小化光毒性和光漂白。

定量圖像分析

為了從動態(tài)成像數(shù)據(jù)中提取生物學信息，必須進行嚴謹?shù)亩繄D像分析。這種基于單粒子追蹤（Single Particle Tracking，SPT）的分析流程第一步是軌跡構(gòu)建：首先是定位（Localization），通過高斯擬合等算法，精確確定每一幀中熒光標記位點的坐標；其次是追蹤（Tracking），利用算法連接跨幀的定位點，構(gòu)建出位點的運動軌跡。基于軌跡，即可運用物理學模型提取關(guān)鍵動態(tài)參數(shù)。比如通過計算兩點間距離，觀察染色質(zhì)環(huán)形成等構(gòu)象動態(tài)。

（一）單點動力學分析:

均方位移（Mean Square Displacement, MSD）是表征運動模式的核心指標。通過分析其與時間延遲 τ 的關(guān)系(MSD( τ ) ~ τ α)可區(qū)分不同運動類型：完全隨機的布朗運動（Brownian Motion, α=1），存在主動力量推動的超擴散（Superdiffusion, α>1），運動受限的亞擴散（Subdiffusion, α<1）。多數(shù)研究表明，染色質(zhì)的亞擴散行為與分數(shù)布朗運動（fractional Brownian motion，fBm）模型吻合。這可能源于聚合物鏈的內(nèi)在彈性和擁擠細胞核的粘滯性。速度自相關(guān)（Velocity Autocorrelation， VAC）用于分析粒子運動的時間相關(guān)性。染色質(zhì)運動的VAC通常呈負相關(guān)，這反映了聚合物鏈的粘彈性和回復力。

（二）多點耦合動力學分析：

此分析旨在揭示不同位點間的協(xié)同作用。均方距離變化（Mean Square Change in Distance, MSCD）通過描述兩點間的相對運動，能有效消除整體漂移帶來的噪音。速度互相關(guān)（Velocity Cross Correlation，VCC）是量化兩個位點間動態(tài)耦合的工具。通過將實驗VCC數(shù)據(jù)與Rouse聚合物模型擬合，可以提取應力在染色質(zhì)鏈上的傳播時間（Rouse弛豫時間）。文章還討論了隱馬爾可夫模型（HMM）等工具。

定位誤差不可避免，主要源于靜態(tài)誤差（光子數(shù)有限；光子數(shù)越少，定位精度越低）和動態(tài)誤差（曝光期間分子運動，活細胞成像中尤為突出）。這些誤差可導致對分子間距離的錯誤估計。例如模擬顯示，實際距離< 50 nm的增強子-啟動子對，其表觀測量距離可為150-300 nm。此外，標記物與功能位點間的距離也是誤差來源。因此，解釋數(shù)據(jù)時必須審慎評估和校正定位誤差，以確保結(jié)論的準確性。文章給出了包含校正項的fBm模型下的MSD表達式。

從工具到生物學問題

憑借先進的CRISPR成像工具，我們正以前所未有的時空分辨率探索核心生物學問題。

在染色質(zhì)組織與通訊層面，Oligo-LiveFISH揭示了染色質(zhì)存在著短程“一維順式通訊”和長程“三維反式通訊”兩種信息傳遞模式。

在DNA損傷與修復領域，LiveFISH和fCRISPR等技術(shù)實現(xiàn)了實時追蹤損傷位點上修復因子（如53BP1）的招募與解離，直擊修復的第一現(xiàn)場。

關(guān)于增強子-啟動子互作與轉(zhuǎn)錄的關(guān)系，亓磊（Oligo-LiveFISH），Thomas Gregor和陳寶惠（TriTag）等實驗室的發(fā)現(xiàn)表明轉(zhuǎn)錄過程伴隨著對染色質(zhì)運動的“限制”。但也有研究發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)錄反而會增加其動態(tài)性。要解決此爭議，高分辨率同步追蹤染色質(zhì)和新生RNA將是關(guān)鍵。

總之，CRISPR活細胞成像技術(shù)通過實現(xiàn)對非重復基因組和內(nèi)源RNA的動態(tài)觀測，正推動整個領域從靜態(tài)描述向動態(tài)機制研究發(fā)生深刻的范式轉(zhuǎn)變。

展望未來，將CRISPR成像與CRISPRa/i、表觀遺傳編輯等“擾動”技術(shù)相結(jié)合，將能建立起三維基因組動態(tài)、基因調(diào)控與疾病之間的因果關(guān)系。其最終目標是解碼基因調(diào)控的空間邏輯，加速在免疫學, 腫瘤學, 神經(jīng)生物學等領域的治療性突破，并拓展其臨床診斷潛力。

本文第一作者朱彥宇博士為斯坦福大學生物工程系博士后，本科畢業(yè)于北京大學化學與分子工程學院，博士畢業(yè)于威斯康星麥迪遜大學化學系物理化學專業(yè)。通訊作者為斯坦福大學生物工程系的亓磊教授和斯坦福大學化學系的W.E.Moerner教授。亓磊教授課題組開發(fā)了廣泛使用的基于CRISPR的基因調(diào)控 (CRISPR a/i)，基因組三維結(jié)構(gòu)調(diào)控 (CRISPR-GO) 和基因組成像 (LiveFISH, Oligo-LiveFISH) 的工具等。這些工作從最初的 DNA 成像工具開發(fā)，到能夠觀測原代細胞DNA的 LiveFISH ，再到能觀測非重復序列的高分辨率 的Oligo-LiveFISH，開啟了活細胞內(nèi)觀察基因組動力學的新紀元。W.E.Moerner教授在單分子光譜學和超分辨率熒光顯微鏡領域具有開創(chuàng)性貢獻。

原文鏈接：https://www.nature.com/articles/s41576-026-00949-z

制版人： 十一

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