Nature?|?同一非編碼RNA竟致兩種罕見(jiàn)病？飽和編輯繪出RNU4-2“雙面”致病圖譜

撰文|亦

RNU4-2 編碼主要剪接體的U4 snRNA【1】，其新發(fā)變異近期被發(fā)現(xiàn)是導(dǎo)致ReNU綜合征（一種全球預(yù)計(jì)影響數(shù)萬(wàn)人的常見(jiàn)神經(jīng)發(fā)育障礙）的原因【2,3】。然而，在飽和基因組編輯（saturation genome editing，SGE）實(shí)驗(yàn)開(kāi)展前，領(lǐng)域?qū)υ摶蜃儺惻c臨床影響的精確關(guān)系認(rèn)知存在重大空白：已知致病變異高度聚集在18個(gè)核苷酸的關(guān)鍵區(qū)域內(nèi)，但關(guān)鍵區(qū)域外是否存在致病變異尚不明確。高達(dá)75%的患者攜帶同一個(gè)單堿基插入突變（n.64_65insT），其高復(fù)發(fā)率的原因未知。此外，現(xiàn)有的計(jì)算機(jī)預(yù)測(cè)工具（如CADD）無(wú)法有效區(qū)分 RNU4-2 的致病與良性變異。由于 RNU4-2 與基因組中的假基因及同源基因（如 RNU4-1 ）序列高度同源，此前缺乏可靠的實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ蛠?lái)評(píng)估變異功能。

近日，弗朗西斯·克里克研究所Gregory M. Findlay團(tuán)隊(duì)與牛津大學(xué)Nicola Whiffin團(tuán)隊(duì)合作，共同在Nature上發(fā)表了題為Saturation editing ofRNU4-2reveals distinct dominant and recessive disorders的文章。研究 研究通過(guò)開(kāi)發(fā)針對(duì)高同源區(qū)域的SGE策略，解決了上述問(wèn)題，不僅提供了全基因范圍的變異效應(yīng)圖譜以指導(dǎo)精準(zhǔn)診斷，還進(jìn)一步揭示了該基因不同結(jié)構(gòu)域變異導(dǎo)致顯性與隱性兩種截然不同疾病的分子機(jī)制。

為了系統(tǒng)評(píng)估 RNU4-2 基因上所有可能變異的生物學(xué)效應(yīng)，研究團(tuán)隊(duì)建立了一套針對(duì)該基因的飽和基因組編輯體系 。由于 RNU4-2 與假基因序列高度相似，直接編輯和擴(kuò)增目標(biāo)區(qū)域存在技術(shù)挑戰(zhàn)。研究者選擇在近單倍體HAP1細(xì)胞中進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，通過(guò)CRISPR-Cas9在基因上游獨(dú)特序列處引入DNA雙鏈斷裂，并導(dǎo)入一個(gè)包含539種預(yù)設(shè)變異的文庫(kù)，涵蓋轉(zhuǎn)錄本內(nèi)所有可能的單堿基替換、關(guān)鍵區(qū)域的1個(gè)核苷酸插入缺失及部分多堿基插入。實(shí)驗(yàn)通過(guò)比較細(xì)胞在第4天和第14天的變異頻率變化，計(jì)算出每個(gè)變異的功能評(píng)分，負(fù)分代表變異導(dǎo)致細(xì)胞生長(zhǎng)受阻。為確保評(píng)分的可靠性，研究者在文庫(kù)中納入了12個(gè)位于關(guān)鍵區(qū)域外莖環(huán)結(jié)構(gòu)的1個(gè)核苷酸插入作為陰性對(duì)照，其平均功能評(píng)分為-0.009。 以這些對(duì)照為基準(zhǔn)，確定了151個(gè)顯著有害的變異。這些有害變異并非均勻分布，而是高度聚集在基因的特定區(qū)域，初步繪制出 RNU4-2 的功能效應(yīng)圖譜 。

獲得功能評(píng)分后，研究者驗(yàn)證其能否有效區(qū)分已知致病與良性變異 。他們 將變異分為三類：已在ReNU綜合征患者中發(fā)現(xiàn)的、在UK Biobank或All of Us等大型人群數(shù)據(jù)庫(kù)中觀察到的，以及兩者均未出現(xiàn)的 。結(jié)果顯示，所有18個(gè)ReNU綜合征相關(guān)變異均功能評(píng)分顯著低于-0.302，而人群數(shù)據(jù)庫(kù)中81.0%（286/353）的變異評(píng)分正常。功能評(píng)分對(duì)二者的區(qū)分能力極佳，受試者工作特征曲線下面積（AUC）高達(dá)0.93，遠(yuǎn)優(yōu)于計(jì)算機(jī)預(yù)測(cè)工具CADD（AUC僅為0.65）?；谶@些數(shù)據(jù)，研究者將原先18個(gè)核苷酸的關(guān)鍵致病區(qū)域精確定義為兩個(gè)更小區(qū)段：包含n.61_62插入位點(diǎn)的n.62-70區(qū)（對(duì)應(yīng)T-loop），以及n.75-78區(qū)（對(duì)應(yīng)Stem III）。在這兩個(gè)區(qū)域中，85.4%（76/89）的受測(cè)變異表現(xiàn)出功能缺失，包括全部ReNU致病變異；而基因其余區(qū)域僅17.4%的變異評(píng)分顯著。研究進(jìn)一步通過(guò)高斯混合模型將功能評(píng)分校準(zhǔn)為臨床證據(jù)等級(jí)，為此前意義不明的變異（如n.76del、n.92C>G）提供了明確的良性判讀依據(jù)。

明確功能評(píng)分可定性區(qū)分致病變異后，研究進(jìn)一步探究評(píng)分?jǐn)?shù)值是否能量化反映疾病嚴(yán)重程度 。研究者 將關(guān)鍵區(qū)域內(nèi)的有害變異按評(píng)分分為“強(qiáng)有害”（低于-0.90）和“中度有害”（介于-0.90至-0.302之間） ，并結(jié)合143名ReNU綜合征患者的臨床表型數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。表型主成分聚類顯示，攜帶中度有害變異（如n.63T>C和n.65A>G）的患者聚集在一起，與攜帶強(qiáng)有害變異的患者明顯分離。具體表型對(duì)比中，強(qiáng)有害組患者出現(xiàn)嚴(yán)重發(fā)育遲緩、嚴(yán)重智力障礙和言語(yǔ)能力極差的比例均顯著更高。同時(shí)，基于患者RNA測(cè)序數(shù)據(jù)的剪接事件主成分分析也顯示，強(qiáng)有害組與對(duì)照組的剪接模式差異更大，而中度有害組則介于中間。這表明 SGE功能評(píng)分不僅能定性判斷致病性，其量化數(shù)值還可預(yù)測(cè)ReNU綜合征的臨床嚴(yán)重程度 。

在研究ReNU綜合征關(guān)鍵區(qū)域的同時(shí)，研究者注意到該區(qū)域之外也存在75個(gè)功能評(píng)分顯著有害的變異，且其中84.0%可在人群數(shù)據(jù)庫(kù)中以極低頻率被觀察到。 由于SGE實(shí)驗(yàn)在單倍體細(xì)胞中進(jìn)行，這些變異若在人群中以雜合狀態(tài)存在時(shí)未見(jiàn)疾病關(guān)聯(lián)，則可能以隱性方式致病 。研究團(tuán)隊(duì)在全球罕見(jiàn)病隊(duì)列中篩選并確認(rèn)了20名攜帶雙等位基因功能缺失變異的神經(jīng)發(fā)育障礙患者。這些變異全部位于ReNU關(guān)鍵區(qū)域之外，且精確映射到U4 snRNA與剪接體其他組分相互作用的四個(gè)結(jié)構(gòu)域：與U6相互作用的Stem II中央?yún)^(qū)、蛋白質(zhì)結(jié)合所需的“k-turn”結(jié)構(gòu)、Sm蛋白結(jié)合區(qū)以及末端莖環(huán)。值得關(guān)注的是，其中5個(gè)變異位點(diǎn)在編碼次要剪接體同源組分的RNU4ATAC基因上有完全對(duì)等的已知隱性致病變異。這一發(fā)現(xiàn) 揭示了 RNU4-2 的一種全新隱性遺傳神經(jīng)發(fā)育障礙，其臨床特征（如白質(zhì)異常和小腦萎縮）與顯性ReNU綜合征截然不同，體現(xiàn)了同一非編碼RNA基因通過(guò)不同區(qū)域的變異可引發(fā)遺傳模式與臨床表型均迥異的兩類疾病 。

綜上所述，本研究對(duì)非編碼RNA基因RNU4-2進(jìn)行了飽和基因組編輯，系統(tǒng)繪制了整個(gè)基因上所有可能變異的細(xì)胞適應(yīng)性功能圖譜 。 研究在關(guān)鍵區(qū)域之外發(fā)現(xiàn)了四個(gè)與剪接體蛋白結(jié)合相關(guān)的功能必需區(qū)域，這些區(qū)域的變異會(huì)導(dǎo)致一種全新的、臨床特征與ReNU綜合征截然不同的隱性神經(jīng)發(fā)育障礙 。這項(xiàng)工作不僅為 RNU4-2 變異的臨床診斷提供了關(guān)鍵的量化證據(jù)，還揭示了該基因通過(guò)顯性與隱性兩種不同遺傳模式導(dǎo)致不同疾病的遺傳多效性機(jī)制。

https://doi.org/10.1038/s41586-026-10334-9

制版人： 十一

參考文獻(xiàn)

1. Nguyen, T. H. D. et al. The architecture of the spliceosomal U4/U6.U5 tri-snRNP.Nature523, 47–52 (2015) .

2. Chen, Y. et al. De novo variants in the RNU4-2 snRNA cause a frequent neurodevelopmental syndrome.Nature632, 832–840 (2024) .

3. Greene, D. et al. Mutations in the U4 snRNA gene RNU4-2 cause one of the most prevalent monogenic neurodevelopmental disorders.Nat. Med.30, 2165–2169 (2024) .

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