海南醫(yī)科大學(xué)李其富/王燕/復(fù)旦大學(xué)李智平揭示開(kāi)啟抗癲癇+神經(jīng)保護(hù)雙效治療新策略

癲癇不僅是“大腦放電異常”，發(fā)作過(guò)程中還會(huì)引發(fā)強(qiáng)烈的氧化應(yīng)激和神經(jīng)炎癥，導(dǎo)致神經(jīng)元損傷甚至死亡。科學(xué)家一直在尋找大腦自身的“保護(hù)機(jī)制”，有沒(méi)有什么分子能在癲癇發(fā)生時(shí)挺身而出，減輕傷害？

基于此，海南醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科李其富、海南醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院王燕和國(guó)家兒童醫(yī)學(xué)中心·復(fù)旦大學(xué)附屬兒科醫(yī)院臨床藥學(xué)部/復(fù)旦大學(xué)附屬兒科醫(yī)院昆山分院李智平研究團(tuán)隊(duì)在《Redox Biology》雜志發(fā)表了“ABCG2 shields against epilepsy, relieves oxidative stress and apoptosis via inhibiting the ISGylation of STAT1 and mTOR”揭示了ABCG2通過(guò)抑制STAT1和mTOR的ISG15化修飾抵御癲癇、緩解氧化應(yīng)激和細(xì)胞凋亡。

本研究發(fā)現(xiàn)，在癲癇模型中，ABCG2表達(dá)迅速升高，并發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用：體外過(guò)表達(dá)ABCG2可顯著減輕谷氨酸、紅藻氨酸（KA）和LPS誘導(dǎo)的神經(jīng)元與小膠質(zhì)細(xì)胞氧化應(yīng)激及凋亡，而抑制ABCG2則消除該保護(hù)效應(yīng)。體內(nèi)實(shí)驗(yàn)顯示，ABCG2基因敲除小鼠（ABCG2?/?）在戊四氮（PTZ）誘導(dǎo)下生存時(shí)間更短、存活率更低。ABCG2缺失導(dǎo)致STAT1蛋白積累、mTOR磷酸化減少及ISG15化修飾增強(qiáng)；而ABCG2過(guò)表達(dá)可直接結(jié)合STAT1和mTOR，抑制其ISG15化。結(jié)果表明，ABCG2在癲癇早期快速上調(diào)具有保護(hù)作用，有望成為抗癲癇治療的新靶點(diǎn)。

圖一 ABCG2在多種癲癇模型海馬中瞬時(shí)上調(diào)

研究發(fā)現(xiàn)，無(wú)論是用高劑量戊四氮（60 mg/kg）誘導(dǎo)急性癲癇，還是用亞驚厥劑量（35 mg/kg）或紅藻氨酸建立慢性癲癇模型，ABCG2蛋白在小鼠和大鼠海馬中均顯著升高，但mRNA僅在急性期或慢性早期短暫增加，提示其表達(dá)具有“快速響應(yīng)、持續(xù)保護(hù)”的特點(diǎn)。這種變化僅出現(xiàn)在海馬，皮層無(wú)明顯改變。慢性給予紅藻氨酸的小鼠在第7天和第30天的曠場(chǎng)試驗(yàn)（）中顯示中央?yún)^(qū)域活動(dòng)周期減少。

進(jìn)一步通過(guò)細(xì)胞標(biāo)記染色發(fā)現(xiàn)，ABCG2主要在神經(jīng)元中表達(dá)，小膠質(zhì)細(xì)胞中有少量表達(dá)，而星形膠質(zhì)細(xì)胞幾乎不表達(dá)。

這些結(jié)果表明：干擾GABA或谷氨酸系統(tǒng)可觸發(fā)海馬神經(jīng)元快速上調(diào)ABCG2蛋白，可能是大腦應(yīng)對(duì)癲癇損傷的一種自我保護(hù)機(jī)制。

圖二 ABCG2在癲癇相關(guān)刺激下于神經(jīng)元和小膠質(zhì)細(xì)胞中上調(diào)

作者在體外用谷氨酸、紅藻氨酸和脂多糖模擬癲癇相關(guān)損傷，發(fā)現(xiàn)這些刺激物可在神經(jīng)元（HT22）和小膠質(zhì)細(xì)胞（BV2）中瞬時(shí)誘導(dǎo)ABCG2表達(dá)：

谷氨酸（5 mM）或紅藻氨酸（150 μM）處理后，ABCG2蛋白在12–24小時(shí)內(nèi)明顯升高，隨后逐漸回落；

長(zhǎng)時(shí)間刺激（如96小時(shí)谷氨酸）則主要提升ABCG2的mRNA水平；

在BV2小膠質(zhì)細(xì)胞中，脂多糖和紅藻氨酸同樣引起ABCG2 mRNA和蛋白同步增加。

結(jié)果表明，多種癲癇相關(guān)因子可在體外快速激活A(yù)BCG2表達(dá)，提示其是神經(jīng)細(xì)胞應(yīng)對(duì)損傷的早期保護(hù)反應(yīng)。

圖三 CRISPR-CAS9敲除ABCG2縮短了急性戊四氮誘導(dǎo)小鼠的生存時(shí)間并降低存活率

作者構(gòu)建了基于CRISPR的基因敲除小鼠，以進(jìn)一步驗(yàn)證ABCG2在癲癇中的作用。

與野生型小鼠相比，ABCG2?/?小鼠中ABCG2 mRNA表達(dá)顯著降低。與野生型小鼠相比，ABCG2?/?小鼠在4至9周齡期間體重正常，僅在6周齡時(shí)例外。與野生型小鼠相比，ABCG2?/?小鼠在第6周曠場(chǎng)試驗(yàn)中中央?yún)^(qū)域活動(dòng)距離顯著減少，第8周糞便計(jì)數(shù)增加，但其他周未見(jiàn)差異，提示ABCG2缺失對(duì)認(rèn)知功能的影響有限。

然而，當(dāng)ABCG2?/?小鼠腹腔注射90 mg/kg戊四氮后，潛伏期和2-5級(jí)癲癇發(fā)作次數(shù)未見(jiàn)明顯改變，但與野生型小鼠相比生存時(shí)間顯著縮短、存活率降低，表明ABCG2缺失并未導(dǎo)致癲癇易感性增加，但加重了癲癇相關(guān)的死亡。

圖四 ABCG2、STAT1和mTOR之間的直接相互作用

作者推測(cè)ABCG2、mTOR和STAT1之間存在直接相互作用，因?yàn)閙TOR和STAT1是獨(dú)立調(diào)控的。因此在經(jīng)谷氨酸處理或未處理的HT22細(xì)胞中進(jìn)行了免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)，結(jié)果表明ABCG2與STAT1和mTOR結(jié)合，而谷氨酸誘導(dǎo)的HT22細(xì)胞顯示出增強(qiáng)的相互作用。

此外，通過(guò)免疫熒光染色，在谷氨酸處理的HT22細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核中，mTOR或STAT1與ABCG2顯示出明顯的共定位，提示ABCG2的瞬時(shí)過(guò)表達(dá)與mTOR和STAT1發(fā)生接觸。

總結(jié)

本研究發(fā)現(xiàn)，ABCG2在癲癇早期瞬時(shí)上調(diào)，通過(guò)與STAT1和mTOR形成復(fù)合物，抑制二者的ISG15化修飾，從而促進(jìn)mTOR磷酸化、減少STAT1積累，有效緩解神經(jīng)元和小膠質(zhì)細(xì)胞的氧化應(yīng)激與凋亡。ABCG2缺失則導(dǎo)致該復(fù)合物解離，加劇mTOR失活與STAT1介導(dǎo)的損傷。本研究揭示ABCG2通過(guò)抑制STAT1/mTOR的ISG15化修飾發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用，為癲癇治療提供了新靶點(diǎn)和新機(jī)制。

文章來(lái)源：

https://doi.org/10.1016/j.redox.2024.103262

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