PNAS丨李?yuàn)?歐陽(yáng)松應(yīng)團(tuán)隊(duì)合作揭示病原菌效應(yīng)蛋白通過(guò)劫持宿主黏著斑信號(hào)通路調(diào)控細(xì)菌感染新策略

革蘭氏陰性病原菌如腸致病性大腸桿菌、沙門(mén)氏菌、志賀氏菌、耶爾森菌、銅綠假單胞菌、伯克霍爾德菌等均擁有Ⅲ型分泌系統(tǒng)（ Type III Secretion System ， T3SS ）。這些致病菌會(huì)利用 T3SS 直接向宿主細(xì)胞內(nèi)注射毒力蛋白（效應(yīng)蛋白），進(jìn)而操控宿主細(xì)胞信號(hào)通路，以利于細(xì)菌自身在宿主細(xì)胞內(nèi)的生存、 定殖 和傳播【1】。因此，鑒定和解析病原菌 T3SS 效應(yīng)蛋白的生理功能及 其 分子作用機(jī)制，對(duì)于深入認(rèn)識(shí)病原微生物的致病機(jī)理，進(jìn)而研發(fā)相應(yīng)的疫苗和治療性藥物具有重要意義 。 紫色桿菌基因組編碼了 兩 套 T3SS ，分別是 Cpi-1/-1a T3SS 和 Cpi-2 T3SS ；且已有研究表明紫色桿菌的毒力主要依賴于 Cpi-1/-1a T3SS【2】。 紫色桿菌屬于胞內(nèi)菌， 其 清除依賴于宿主細(xì)胞的死亡 ，死亡后的宿主細(xì)胞再 將其暴露給中性粒細(xì)胞 予以清除【3】。在 免疫細(xì)胞 中 （如 巨噬細(xì)胞 ） ，其 T3SS 裝置中的針狀蛋白 CprI 可通過(guò)激活 NLRC4-caspase-1 炎癥小體引發(fā)細(xì)胞焦亡【4】； 但紫色桿菌與上皮細(xì)胞 膜破損型 死亡 進(jìn)程 之間有怎樣的調(diào)控關(guān)系，此前報(bào)道 甚少 。

近日， 南方科技大學(xué) 醫(yī)學(xué)院 / 穩(wěn)態(tài)醫(yī)學(xué)研究院李?yuàn)?/strong>團(tuán)隊(duì) 聯(lián)合福建師范大學(xué)歐陽(yáng)松應(yīng)團(tuán)隊(duì) 在 美國(guó)國(guó)家科學(xué)院院刊PNAS雜志 在線發(fā)表題為 Pathogen hijacks focal adhesion signaling by a T3SS effector CteX 的論文。文章鑒定出了紫色桿菌T3SS新型效應(yīng)蛋白CteX，并證實(shí)其作為半胱氨酸蛋白酶能夠特異性切割宿主黏著斑支架蛋白Paxillinα，進(jìn)而通過(guò)調(diào)控宿主細(xì)胞骨架重塑實(shí)現(xiàn)細(xì)菌持續(xù)定殖和致病的分子機(jī)制，該研究為解析病原菌的致病策略提供了新的視角。

紫色桿菌廣泛存在于熱帶及亞熱帶的土壤與河流中，屬于機(jī)會(huì)致病菌。但人體一旦感染該菌，可引起嚴(yán)重的皮膚、肝、脾膿腫和壞死，致死率極高【5】。 紫色桿菌 的致病力依賴于其編碼的 Cpi-1/-1a T3SS ， 該 系統(tǒng)能向宿主細(xì)胞內(nèi)注射效應(yīng)蛋白，操控宿主細(xì)胞的生理過(guò)程，為細(xì)菌的入侵、定殖創(chuàng)造條件【6-8】。然而，紫色桿菌 Cpi-1/-1a T3SS 的效應(yīng)蛋白 組 未 被全面解析， 成為 了 解析該菌致病機(jī)制的關(guān)鍵瓶頸 。 為了解決該問(wèn)題 ，研究團(tuán)隊(duì)率先開(kāi)展了紫色桿菌 Cpi-1/-1a T3SS 分泌 組的定量蛋白質(zhì)組學(xué)分析，發(fā)現(xiàn)了一個(gè)無(wú)已知功能注釋的新型分泌蛋白 CV0255 ，并將其命名為 CteX （ Chromobacterium translocated effector X ）。通過(guò)分泌和 細(xì)胞 轉(zhuǎn)位實(shí)驗(yàn)證實(shí) CteX 是 一 個(gè) Cpi-1/-1a T3SS 全新的 效應(yīng)蛋白。 為 了 探究 CteX 的功能，研究團(tuán)隊(duì)解析了其 1.5 ? 的高分辨率晶體結(jié)構(gòu)，發(fā)現(xiàn) CteX 采用典型的木瓜樣折疊，具有由 C149 、 H280 、 E295 組成的催化三聯(lián)體，且存在保守的氧陰離子孔結(jié)構(gòu)。 在真核和原核表達(dá)體系 中 ， CteX 蛋白 能夠發(fā)生自 切割 ，其催化三聯(lián)體的突變會(huì)完全喪失 自 切割 能力， 證實(shí) CteX 是一個(gè) 木瓜樣 半胱氨酸 蛋白酶 。

CteX 能夠顯著地抑制釀酒酵母（ S. cerevisiae ）生長(zhǎng)，表明其具有真核生物毒性。在 HeLa 細(xì)胞中表達(dá)時(shí)，細(xì)胞骨架劇烈收縮 、變圓。為了排除真核過(guò)表達(dá)體系中因 CteX 蛋白表達(dá)量的過(guò)高進(jìn)而可能產(chǎn)生的干擾，我們將原核純化的 CteX 蛋白遞送進(jìn)入 宿主 細(xì)胞，結(jié)果顯示， 50 pmol /L 的 CteX 蛋白 即可使 100% 的 HeLa 細(xì)胞變圓，表明 CteX 具有極強(qiáng)的生物學(xué)活性。

研究團(tuán)隊(duì)通過(guò)底物篩選發(fā)現(xiàn)， CteX 能特異性切割宿主 黏著斑的核心支架蛋白 Paxillinα ，而對(duì) Paxillin 家族的其他成員（ Paxillinβ 、 Hic-5 、 Leupaxin ）無(wú)切割作用。研究進(jìn)一步發(fā)現(xiàn) CteX 是通過(guò) “ 雙篩選 ” 機(jī)制實(shí)現(xiàn)底物的嚴(yán)格特異性：其底物結(jié)合口袋的疏水凹槽（ L126/L129 ）是切割的必要條件，而相鄰的正電荷簇（ K125/K145 ）則負(fù)責(zé)排斥非靶標(biāo)底物。 Paxillinα 作為黏著斑的核心，能招募 FAK 、 Vinculin 、 GIT1 等多種信號(hào)蛋白形成復(fù)合物，調(diào)控黏著斑的組裝與功能。研究團(tuán)隊(duì)通過(guò)免疫共沉淀、活細(xì)胞成像、鄰近生物素化標(biāo)記（ BioID ）技術(shù)等實(shí)驗(yàn)證實(shí)， CteX 對(duì) Paxillinα 的切割會(huì)破壞其與下游信號(hào)蛋白的相互作用，導(dǎo)致黏著斑復(fù)合物解體，進(jìn)而引發(fā)宿主肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架的破壞，表現(xiàn)為宿主細(xì)胞的變圓表型。

研究團(tuán)隊(duì)發(fā)現(xiàn) CteX 介導(dǎo)的細(xì)胞骨架重塑并非簡(jiǎn)單促進(jìn)細(xì)菌入侵，而是呈現(xiàn)出 “ 自限性感染 ” 的獨(dú)特調(diào)控模式。敲除 cteX 基因的紫色桿菌對(duì)上皮細(xì)胞的入侵效率顯著升高，過(guò)度的細(xì)菌入侵會(huì)導(dǎo)致宿主細(xì)胞發(fā)生劇烈的裂解性死亡，反而使細(xì)菌過(guò)早暴露于宿主免疫環(huán)境中被清除。而野生型細(xì)菌通過(guò)分泌 CteX 限制過(guò)度入侵，減少宿主細(xì)胞的死亡，從而實(shí)現(xiàn)細(xì)菌在宿主細(xì)胞內(nèi)的持續(xù)存活。在小鼠感染模型中， Δ cteX 突變株在感染早期的肝臟載菌量顯著高于野生型，但在感染后期其定殖能力急劇下降，小鼠的存活率顯著升高，且肝臟的病理?yè)p傷明顯減輕?；匮a(bǔ)野生型 CteX 能恢復(fù)菌株的致病力，而補(bǔ)回蛋白酶失活的 CteX 則無(wú)此效果，證實(shí) CteX 的蛋白酶活性是紫色桿菌體內(nèi)持續(xù)定殖和致病的關(guān)鍵。

綜上，該研究首次完成了紫色桿菌 Cpi-1/-1a T3SS 分泌組的全面解析，鑒定出新型效應(yīng)蛋白 CteX ；發(fā)現(xiàn) CteX 是首個(gè)直接靶向宿主黏著斑核心蛋白 Paxillinα 的細(xì)菌蛋白酶，揭示了病原菌操控宿主黏著斑信號(hào)通路的全新方式；闡明了 CteX 家族 通過(guò) “ 自限性感染 ” 調(diào)控細(xì)菌入侵效率，實(shí)現(xiàn)體內(nèi)持續(xù)定殖的獨(dú)特致病策略，為理解病原菌與宿主的共進(jìn)化博弈提供了新的范例。

論文的通訊作者是南方科技大學(xué)李?yuàn)櫻芯繂T和福建師范大學(xué)歐陽(yáng)松應(yīng)教授。第一作者是李?yuàn)檲F(tuán)隊(duì)博士研究生潘興、羅紀(jì)維和歐陽(yáng)松應(yīng)團(tuán)隊(duì) 講師 趙燕波。 特別感謝吉林大學(xué)羅招慶教授，南方科技大學(xué)饒海教授，華中農(nóng)業(yè)大學(xué)李禮研究員對(duì)本項(xiàng)目的學(xué)術(shù)指導(dǎo)和技術(shù)支持。

原文鏈接：https://doi.org/10.1073/pnas.2530673123

制版人：十一

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