Mol?Ther?| 王華婷/孫昊團隊系統繪制CRISPR/Cas9體內編輯修復圖譜，助力提升基因治療安全性

CRISPR/Cas9 技術憑借高效的基因組編輯能力，已在基礎研究與臨床治療中展現出巨大應用潛力。在不提供修復模板的情況下，Cas9 誘導產生的 DNA 雙鏈斷裂（DSB）主要通過非同源末端連接（NHEJ）與微同源介導的末端連接（MMEJ）等途徑完成修復。盡管體外研究已對該技術的修復產物開展了廣泛探索，但在復雜的體內組織微環境中，DNA 修復的具體特征仍缺乏系統性解析。更需要關注的是，近年研究表明，Cas9 編輯會伴隨大片段缺失、外源載體整合、染色質重排等高危副產物，即便使用高保真 Cas9 也難以完全避免。這類副產物在體內的發生頻率、形成規律及調控機制，始終是領域內亟待填補的關鍵空白。

近日，香港中文大學王華婷教授團隊與香港中文大學（深圳）孫昊教授團隊合作，在 Molecular Therapy 期刊上發表了題為In vivo systematic detection of the outcomes of CRISPR/Cas9 mediated DNA repair in skeletal muscle stem cells 的研究論文。該研究依托團隊成熟的CRISPR/Cas9/AAV9-sgRNA體內編輯平臺，在骨骼肌干細胞（MuSC）中對95個基因組位點的CRISPR/Cas9修復產物進行了系統解析，全面揭示了體內小片段插入缺失（indel）的形成規律。更重要的是，該研究發現體內編輯中大片段缺失（Large deletion，LD）以及外源/內源序列的大片段插入（Large insertion，LI）廣泛存在，并闡明了NHEJ與MMEJ修復通路在其中的差異化分工，為提升體內CRISPR基因治療的安全性提供了關鍵理論指導與優化策略。

1. 體內修復圖譜的首次系統性描繪

通過系統性分析體內多位點的編輯產物，研究團隊發現整體indel的形成規律總體與體外一致：其一，各位點的編輯效率差異明顯，且與染色質開放性以及活躍程度呈正相關性。其二，indel的形成并非隨機，其模式具有高度重復性。其三，在所有編輯事件中，缺失（deletion）占主導地位，其中大多數deletion的形成由微同源序列（MH）介導，而deletion的形成與編輯的精準度（editing precision）存在一定的負相關性。其四，雖然NHEJ常被視為易錯修復，但本研究發現NHEJ介導形成的1-3 bp insertion呈現模版化插入（templated insertion，TI），且插入的堿基與Cas9切割位點上游-4bp~-6 bp位置的堿基一致，表明體內NHEJ介導的短片段插入具有高度可預測性。最后，Cas9切割位點上下游的堿基組成可直接影響indel的形成。

2. 大片段缺失與插入在體內編輯中普遍存在

該研究最重要的發現是除了預期的小片段 indel之外，CRISPR/Cas9 體內編輯過程中同樣會在編輯位點引入大片段的基因組變異（large on target modifciation），包括大片段缺失（LD，≥50 bp）和大片段插入（LI，≥20 bp）。其中，絕大多數LD的形成需要MH的存在，暗示 MMEJ是其形成的主要途徑。值得注意的是LI呈現出極高的復雜性，不僅包含外源性 AAV 載體片段的整合（AAV-LI），還包括來源于細胞自身基因組的內源性 DNA 片段插入（Endo-LI），這在以往的研究中被嚴重忽視。Endo-LI更傾向來源于基因組的活躍區域（如啟動子、增強子、逆轉錄轉座子）。通過整合Hi-C數據，團隊首次證實Endo-LI的形成強烈依賴于三維基因組空間鄰近性：絕大多數供體序列與DSB 位點位于同一個拓撲相關結構域（TAD）內，這表明染色質的空間結構在Endo-LI的形成過程中扮演著重要角色。同時，作為基因治療中廣泛使用的載體，AAV整合在體內編輯中普遍存在，所有位點均可檢測到 AAV-LI。提高AAV劑量雖能提升編輯效率，但會呈劑量依賴性地顯著增加AAV整合風險。研究團隊還發現Cas9切割位點上下游的堿基組成與這些大片段基因組變異的形成密切相關，提示可通過篩選特定序列特征的位點降低此類變異的產生。

3. NHEJ 和 MMEJ在體內修復產物形成過程中的差異化功能

為厘清這些大片段基因組變異的形成機制，研究團隊分別在體內敲除了NHEJ（Ku80、Lig4）和MMEJ（Nbn、Polq）通路的關鍵因子。結果顯示，抑制NHEJ（Ku80或Lig4缺失）導致LD顯著增加，同時Lig4缺失還會促進Endo-LI的頻率但減少AAV-LI的形成；而抑制MMEJ（Nbn缺失）則降低LD的頻率，但Polq缺失在體內對LD的影響不如體外顯著。上述結果說明，NHEJ 與 MMEJ 在體內 Cas9 介導的修復產物形成中承擔著不同功能。

4.提高體內 CRISPR 基因治療安全性的潛在策略

基于上述發現，研究團隊提出了三項提升體內編輯安全性的潛在策略：1）. 優先采用非病毒遞送系統（如LNP遞送Cas9 mRNA），從根本上規避AAV整合風險；2）. 選擇特定序列特征（如 -3 bp 位置為 G）的位點，以提高編輯的精準度，同時減少大片段基因組變異的形成；3）. 聯合小分子藥物調控修復通路，通過減小MMEJ的活性，將修復導向更精確的NHEJ通路。

總而言之，這項研究首次在生理環境下系統性描繪了CRISPR/Cas9的修復圖譜。它不僅證實了體外規律在體內的基本適用性，更明確了大片段缺失與插入是普遍存在的潛在風險，并揭示了內源插入受三維基因組調控的新機制。填補了 “從體外到體內” 的關鍵認知空白，為更安全、更精準的體內基因治療提供了重要理論與設計指南。

香港中文大學醫學院王華婷教授和香港中文大學（深圳）醫學院孫昊教授為本文共同通訊作者。香港中文大學醫學院博士后何良強與博士生付陽為本文共同第一作者。

原文鏈接：https://doi.org/10.1016/j.ymthe.2026.04.032

制版人：十一

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