Nat Methods |?朱麟勇/楊弋/陳顯軍團隊合作開發新型近紅外熒光激活蛋白NirFAP680

熒光蛋白的發現與發展極大地推進了生命科學的 研究 進程，眾多科學家通過遺傳突變的方法不斷提升熒光蛋白的理化性質，拓展其應用邊界。 近紅外電磁波在生物系統中具備穿透深、背景信號低以及光毒性小的優點，因此高性能近紅外熒光蛋白是深層組織與活體成像領域的關鍵需求。 然而， 在將熒光蛋白光譜進一步向近紅外波段拓展的探索過程中，無論是 類GFP型近紅外熒光蛋白 還是 基于光敏色素的近紅外熒光蛋白 的 亮度上限受 到了 天然氨基酸種類和內源性生色物質的限制 ， 難以取得進一步突破（量子產率＜0.2）。在此背景下，兼具熒光蛋白可遺傳編碼特性與小分子熒光團 高 亮度優點的熒光遺傳學工具成為新的研究熱點。現有熒光遺傳 學工具 （如HaloTag 或 SNAP-tag 結合 硅羅丹明）在一定程度上克服了紅外波段亮度低的缺點，但仍存在蛋白質標簽尺寸較大（HaloTag約36 kDa）、熒光染料雙光子激發亮度低等不足。因此，開發一種兼具小尺寸 和高亮度 的新型近紅外熒光蛋白具有重要意義。

近日，上海 交通大學 生物醫學工程學院朱麟勇教授團隊與華東理工大學楊弋教授 、陳顯軍教授 團隊在 近紅外熒光激活蛋白的研究中 取得突破性進展，在Nature Methods發表題為NirFAP680: a highly bright andstable large Stokes shift near-infrared fluorogen-activating protein的研究 論文 。 該研究采用熒光生色團與蛋白質標簽共進化策略開發了新型近紅外熒光激活蛋白NirFAP680，其不僅滿足了超分辨、活體成像系統對高亮度近紅外熒光蛋白的需求，同時為基于FRET、BRET原理的生物分析系統提供了具有超高靈敏度的平臺。

研究團隊首先 以GFP生色團為基礎，設計了一種新型近紅外熒光生色團HBMT ， 該分子兼具尺寸 小 、量子產率高、光穩定性 好 以及斯托克斯位移大 等優點 。隨后， 研究 團隊通過定向進化獲得了僅由116個氨基酸組成、 對 HBMT 高親和（Kd = 20 nM）且能大幅激活其 熒光的蛋白標簽NirFAP，成功構建出兼具高亮度與高穩定性的新型近紅外熒光 激活 蛋白 NirFAP680。 NirFAP680激發峰574 nm、發射峰680 nm，斯托克斯位移106 nm，量子產率高達0.56。 該 熒光激活蛋白信噪比高且對pH耐受，能夠 實現活細胞 不同 亞細胞 定位蛋白 的高信噪比成像。

與同波段熒光標簽相比， NirFAP680 具有更小的尺寸，其 分子量約為 miRFP與Halo Tag 的1/3 、 為 類GFP型熒光蛋白 的 1/2 ， 這 將極大地降低 對 所標記 蛋白的 擾動 。 活細胞亮度測試結果顯示 ，NirFAP680在單光子激發 時的 細胞內亮度相較于其他 熒光標簽 實現了 至少一個 數量級的提升 。 雙光子 測試 結 果顯示， NirFAP680 的雙光子吸收截面大于mCardinal 和 HaloTag-SiR，其 在活細胞中較廣泛應用的近紅外標簽 HaloTag-SiR 具有更高的雙光子激發亮度 。

連續成像 結果表明，NirFAP680 在單、雙 光子激發 時均具有 優異 的光 穩定性， 其光穩定性可與 HaloTag-SiR 相 媲美，連續激發 10 分鐘后熒光強度僅發生微弱下降 ，相比之下同類型熒光標簽frFAST在前10秒熒光強度便出現了大幅度下降 。基于上述小尺寸、高亮度及優異 光穩定 性的 特點 ，NirFAP680 成功應用于活細胞微管 、微絲等多種亞細胞結構的 超分辨成像， 且可連續捕獲超過100幀的STED圖像 。

在 優異的光學 性能之外，NirFAP680還具有良好的生物相容性 。 NirFAP680對 斑馬魚 受精卵的發育無影響，可 成功 實現對斑馬魚 發育 動態長達數小時的持續追蹤 。 出眾的 雙光子激發 亮度使其可實現活體斑馬魚 神經 系統的可視化 。 與此同時，本研究驗證了NirFAP能夠在小鼠大 腦 中 廣泛且高效 地 表達 ，HBMT在小鼠大腦中具有良好的組織滲透性 。 因此， NirFAP680 可用于活體小鼠神經網絡結構的可視化 。 上述結果表明NirFAP680在解決深層組織與復雜神經環路高分辨成像方面具有極高的應用價值。

得益于小尺寸與大斯托克斯位移特性，NirFAP680在構建熒光共振能量轉移（FRET）與生物發光共振能量轉移（BRET）體系中展現出極大潛力。 本 研究將 NirFAP680 與 LSSmOrange 結合，構建了斯托克斯位移達 243 nm 的 FRET 對。該體系有效避免了光譜串擾，成功實現了對 活細胞中藥物誘導蛋白質相互作用 及鈣離子 動態 的 高靈敏度 監測。 另一方面，通過 NirFAP680 與 高亮度青色螢光素酶 NanoLuc 的結合，本研究 開發出高亮度 的BRET型 近紅外發光蛋白 NirNL ，其在活體小鼠深層組織中的 發光 強度 顯著優于 基于傳統熒光蛋白構建的BRET型發光蛋白 Antares 。得益于 極低的供體發光 信號 干擾， 該BRET系統 在檢測 藥物誘導蛋白質相互作用 時 信噪比超過 300 倍，遠超 以 傳統 熒光蛋白為能量受體的 BRET系統 ， 為蛋白互作 研究 提供了 超 高靈敏的檢測工具。

綜上所述，本研究開發了兼具小尺寸、高亮度和大斯托克斯位移的新型近紅外熒光激活蛋白 NirFAP680，全面實現了從活細胞超分辨成像、活體深層組織雙光子成像，到基于 FRET/BRET原理的蛋白質互作和信號通路動態的超高靈敏監測。該工作突破了傳統近紅外熒光標簽的技術局限，為未來高性能光學探針的設計提供了可靠的方法學范式。

上海交通大學陳政達 博士 、 華東理工大學 蔣麗 特聘副研究員 為本文共同第一作者，上海交通大學朱麟勇教授與華東理工大學楊弋教授、陳顯軍教授為本文共同通訊作者。

https://www.nature.com/articles/s41592-026-03061-6

制版人： 十一

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