一次奇思妙想，讓免疫熒光技術(shù)造福人類(lèi)

Mitchell Leslie| 撰文

齊 萱 | 翻譯

1939年夏天，對(duì)許多人而言，是去海灘休閑、探訪(fǎng)親友或在國(guó)家公園徒步的好時(shí)機(jī)。而阿爾伯特·庫(kù)恩斯（Albert Coons）卻將時(shí)間花在了觀察尸檢上，思考著白血病以及當(dāng)時(shí)細(xì)菌感染的常見(jiàn)并發(fā)癥——風(fēng)濕熱等疾病。

此時(shí)，這位27歲的年輕人剛在馬薩諸塞州總醫(yī)院完成了為期兩年的實(shí)習(xí)醫(yī)師工作，正等待前往波士頓市立醫(yī)院擔(dān)任助理住院醫(yī)師。

六個(gè)月的假期結(jié)束后，他前往柏林，他有一位朋友在當(dāng)?shù)氐囊患裔t(yī)院擔(dān)任病理學(xué)家。兩人經(jīng)常聚在一起探討科學(xué)和醫(yī)學(xué)問(wèn)題。庫(kù)恩斯回憶說(shuō)，他還將很多時(shí)間用于“閱讀或沉思”。有一天，他開(kāi)始思索風(fēng)濕熱患者心臟中生長(zhǎng)的微小結(jié)節(jié)。醫(yī)生們懷疑，當(dāng)一種未知的細(xì)菌分子引發(fā)免疫反應(yīng)時(shí)，這些結(jié)節(jié)就會(huì)形成。然而，要驗(yàn)證這一假設(shè)，他們需要確認(rèn)引發(fā)反應(yīng)的分子（即抗原）是否隱藏在病變組織中。庫(kù)恩斯在醫(yī)學(xué)培訓(xùn)期間研究過(guò)抗體，他靈機(jī)一動(dòng)，想到可以用一種帶有彩色分子的抗體來(lái)標(biāo)記抗原。

原發(fā)性免疫熒光的基本概念示意圖

庫(kù)恩斯將這個(gè)想法告訴了他的病理學(xué)家朋友，但朋友對(duì)此不以為然。“我覺(jué)得他認(rèn)為這不可行，”庫(kù)恩斯回憶道。然而，這一靈感催生了一種名為免疫熒光的技術(shù)，該技術(shù)后來(lái)成為診斷和研究的主要支柱，當(dāng)時(shí)在哈佛醫(yī)學(xué)院的庫(kù)恩斯也因此獲得了1959年的阿爾伯特·拉斯克基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究獎(jiǎng)。

免疫熒光技術(shù)涉及將熒光化合物附著在抗體上，從而創(chuàng)建出分子定位信標(biāo)。抗體與抗原（通常是一種蛋白質(zhì)）結(jié)合，并發(fā)出信號(hào)，表明其在細(xì)胞、組織或器官中的存在。“我們每天都在實(shí)驗(yàn)室使用這項(xiàng)技術(shù)，”密歇根大學(xué)醫(yī)學(xué)院免疫組織學(xué)實(shí)驗(yàn)室的技術(shù)總監(jiān)史蒂文·赫里卡伊（Steven Hrycaj）說(shuō)道，該實(shí)驗(yàn)室每年分析約15萬(wàn)份患者樣本。“它挽救了生命。”

赫里卡伊表示，免疫熒光技術(shù)的基本原理幾乎沒(méi)有改變。“庫(kù)恩斯所做的幾乎與我們?nèi)缃袼龅耐耆粯印！钡陙?lái)，研究人員也為這項(xiàng)技術(shù)開(kāi)發(fā)了新的應(yīng)用，并拓展了其功能。例如，外科醫(yī)生已利用免疫熒光技術(shù)來(lái)界定腫瘤的邊界，使其更易于切除。

現(xiàn)在免疫熒光技術(shù)不再局限于單一顏色，而是提供了一系列顏色選擇，從而能夠檢測(cè)多種蛋白質(zhì)。“我們可以在單個(gè)樣本上檢測(cè)60種不同的抗體，”匹茲堡大學(xué)的外科病理學(xué)家阿圖爾·辛吉（Aatur Singhi）說(shuō)道。科學(xué)家們也正在努力開(kāi)發(fā)庫(kù)恩斯這一創(chuàng)意的更多用途。

神經(jīng)母細(xì)胞瘤培養(yǎng)細(xì)胞的免疫熒光顯微照片。熒光染料突出顯示細(xì)胞核中的蛋白質(zhì)（黃色）以及細(xì)胞骨架蛋白絲、微管蛋白（綠色）和肌動(dòng)蛋白（藍(lán)色）

庫(kù)恩斯稱(chēng)，他的這一見(jiàn)解“再明顯不過(guò)了”。但斯坦福大學(xué)的免疫學(xué)家休·麥克德維特（Hugh McDevitt）曾撰寫(xiě)一篇對(duì)庫(kù)恩斯職業(yè)生涯的贊賞文章，他表示，庫(kù)恩斯低估了自己的成就。考慮到1939年科學(xué)家們對(duì)抗體了解甚少，“在抗體分子上添加可見(jiàn)標(biāo)記的概念似乎既大膽又新穎。”

然而，將這一概念轉(zhuǎn)化為實(shí)用的實(shí)驗(yàn)室技術(shù)卻并非易事，庫(kù)恩斯在1939年晚些時(shí)候回到美國(guó)后便深有體會(huì)。一方面，他的臨床工作占據(jù)了他大部分時(shí)間。庫(kù)恩斯偶爾進(jìn)入實(shí)驗(yàn)室時(shí)，他嘗試將彩色分子與抗體結(jié)合的努力都失敗了。在獲得一個(gè)研究獎(jiǎng)學(xué)金、擺脫臨床工作后，他才開(kāi)始取得進(jìn)展。庫(kù)恩斯成功地將彩色分子附著在抗體上，并用它們來(lái)標(biāo)記細(xì)菌。但結(jié)果令人失望，因?yàn)椤霸陲@微鏡下，這些生物體只是呈現(xiàn)出淡淡的粉紅色，”他回憶道，“用這種強(qiáng)度的顏色，根本無(wú)法在組織中找到少量的抗原。”

為了增強(qiáng)抗體的熒光效果，庫(kù)恩斯聯(lián)系了哈佛大學(xué)的一位有機(jī)化學(xué)家，后者建議他“‘下樓去和地下室里的兩位研究人員談?wù)劊麄円呀?jīng)在將熒光化合物與蛋白質(zhì)結(jié)合了。’”庫(kù)恩斯與這兩位研究人員合作，將一種在紫外光下發(fā)出藍(lán)色熒光的分子附著在能識(shí)別某些細(xì)菌表面抗原的抗體上。當(dāng)科學(xué)家們將標(biāo)記的抗體添加到細(xì)菌樣本中時(shí)，這些微生物“在紫外光下呈現(xiàn)出明亮的熒光，”庫(kù)恩斯寫(xiě)道。1941年的一篇論文介紹了他們的研究成果。

但這只是第一步，庫(kù)恩斯希望能在患者樣本中檢測(cè)抗原。然而，在紫外光下，組織自然會(huì)產(chǎn)生一種藍(lán)色熒光，掩蓋了標(biāo)記抗體的信號(hào)。為了解決這個(gè)問(wèn)題，他和同事們換用了一種新的標(biāo)記物——一種能發(fā)出綠色熒光的化合物，這種化合物能在人體自然的藍(lán)色背景下脫穎而出。他們還請(qǐng)來(lái)了一位哈佛大學(xué)的化學(xué)專(zhuān)業(yè)研究生來(lái)合成這種化合物。在給抗體裝備上這種分子后，研究人員表明，他們能夠在小鼠組織中定位細(xì)菌。

當(dāng)他們?nèi)〉眠@一突破時(shí)，美國(guó)已卷入了第二次世界大戰(zhàn)。庫(kù)恩斯很快以醫(yī)生的身份加入了軍隊(duì)。他在橫跨全國(guó)的火車(chē)上撰寫(xiě)了描述團(tuán)隊(duì)研究成果的論文，以便能夠前往南太平洋執(zhí)行任務(wù)。一位同事將論文提交給了一家期刊，但庫(kù)恩斯承認(rèn)，直到1943年，當(dāng)期刊的副本“在澳大利亞布里斯班送到我手中時(shí)，我正準(zhǔn)備登船前往北部的巴布亞新幾內(nèi)亞”，他才得知論文的發(fā)表情況。

庫(kù)恩斯在美國(guó)陸軍擔(dān)任了四年的病理學(xué)家和醫(yī)院實(shí)驗(yàn)室服務(wù)主任。1946年回到哈佛后，他希望繼續(xù)開(kāi)展免疫熒光技術(shù)的研究。之前實(shí)驗(yàn)的試劑仍存放在校園的冰箱里，但由于他的化學(xué)同事都不愿意制作他所需的熒光標(biāo)記物，他不得不自己學(xué)習(xí)合成。庫(kù)恩斯與不同的研究人員合作，對(duì)這項(xiàng)技術(shù)進(jìn)行了微調(diào)，并在1950年和1951年發(fā)表的研究中展示了其威力。例如，團(tuán)隊(duì)表明，免疫熒光技術(shù)可以檢測(cè)小鼠體內(nèi)的病毒。庫(kù)恩斯很快轉(zhuǎn)而研究人體如何產(chǎn)生抗體。

在后來(lái)的歲月里，免疫熒光技術(shù)因其特異性、分辨率和簡(jiǎn)便性而在世界各地的診斷實(shí)驗(yàn)室中占據(jù)了一席之地。赫里卡伊表示，他的實(shí)驗(yàn)室每天對(duì)大約20個(gè)樣本進(jìn)行這項(xiàng)檢測(cè)。赫里卡伊說(shuō)，免疫熒光技術(shù)并非從組織樣本中做出診斷的唯一選擇。病理學(xué)家通常更喜歡一種名為免疫組織化學(xué)的類(lèi)似技術(shù)——該技術(shù)涉及用與非熒光分子結(jié)合的抗體來(lái)標(biāo)記抗原——因?yàn)樗烨腋阋恕Ｊ褂妹庖呓M織化學(xué)技術(shù)，只需一臺(tái)標(biāo)準(zhǔn)的明場(chǎng)顯微鏡即可觀察組織樣本的切片，而免疫熒光技術(shù)則需要更昂貴的熒光或共聚焦顯微鏡。盡管如此，免疫熒光技術(shù)仍是診斷某些腎臟和皮膚疾病等病癥的首選方法。“當(dāng)我們需要尋找非常敏感的東西，并且需要進(jìn)行量化時(shí)，免疫熒光技術(shù)就大放異彩了，”辛吉說(shuō)道。不過(guò)，他表示，免疫熒光技術(shù)成本較高且需要專(zhuān)門(mén)的設(shè)備，這使一些診所望而卻步。

成纖維細(xì)胞的免疫熒光顯微照片；細(xì)胞核呈紫色，微管呈紅色

最近的進(jìn)展提高了免疫熒光技術(shù)的診斷價(jià)值。庫(kù)恩斯和他的同事們一次只能檢測(cè)一種抗原。一種名為多重免疫熒光的新技術(shù)于過(guò)去十年間問(wèn)世，它可以使用不同的抗體同時(shí)定位多種抗原，每種抗體都帶有獨(dú)特的顏色。辛吉表示，這種能力對(duì)患者來(lái)說(shuō)非常重要，因?yàn)椴±韺W(xué)家可以從小的組織樣本中提取更多信息。“免疫熒光的未來(lái)在于多重檢測(cè)，”他說(shuō)道。

出于與臨床醫(yī)生相同的許多原因，科學(xué)家們也在工作中采用了免疫熒光技術(shù)。“在研究中，它是標(biāo)準(zhǔn)方法，”赫里卡伊說(shuō)道。這項(xiàng)技術(shù)之所以具有啟發(fā)性，是因?yàn)樗梢源_定特定蛋白質(zhì)的位置、數(shù)量以及它們之間的相互作用——這些信息對(duì)于細(xì)胞生物學(xué)家、神經(jīng)科學(xué)家、免疫學(xué)家、癌癥生物學(xué)家和其他研究人員來(lái)說(shuō)至關(guān)重要。與二維的免疫組織化學(xué)不同，免疫熒光技術(shù)可以使研究人員在三維空間中分析蛋白質(zhì)的分布，從而更清晰地了解組織的結(jié)構(gòu)和功能。

范德比爾特大學(xué)醫(yī)學(xué)中心的埃本·羅森塔爾（Eben Rosenthal）等研究人員為免疫熒光技術(shù)開(kāi)發(fā)了新的應(yīng)用。“我們已經(jīng)將其推進(jìn)到了下一個(gè)合理的階段，那就是將其應(yīng)用于患者，”同時(shí)也是頭頸外科醫(yī)生的羅森塔爾說(shuō)道。大約20年前，羅森塔爾和他的團(tuán)隊(duì)開(kāi)始測(cè)試注射熒光抗體是否可以通過(guò)標(biāo)記腫瘤邊緣來(lái)幫助外科醫(yī)生，因?yàn)槟[瘤邊緣往往難以與健康組織區(qū)分開(kāi)來(lái)。這些研究以及其他科學(xué)家的研究表明，這項(xiàng)技術(shù)可能有益。羅森塔爾表示，使用免疫熒光技術(shù)，“你可以在手術(shù)室實(shí)時(shí)識(shí)別癌癥”，一些外科醫(yī)生也使用這項(xiàng)技術(shù)來(lái)指導(dǎo)手術(shù)刀的操作。

羅森塔爾和他的同事們目前正在努力確定免疫熒光技術(shù)是否可以幫助醫(yī)生選擇接受免疫檢查點(diǎn)抑制劑治療的患者，并微調(diào)這些基于抗體的癌癥治療的劑量。檢查點(diǎn)抑制劑在十多年前首次獲得美國(guó)食品藥品監(jiān)督管理局（FDA）的批準(zhǔn)，得克薩斯大學(xué)MD安德森癌癥中心的詹姆斯·艾利森（James Allison）因此獲得了2015年拉斯克-德貝基臨床醫(yī)學(xué)研究獎(jiǎng)，并分享了2018年諾貝爾生理學(xué)或醫(yī)學(xué)獎(jiǎng)。羅森塔爾表示，研究人員仍未確定這些治療的最佳劑量。“令人驚訝的是，我們認(rèn)為這是精準(zhǔn)醫(yī)療，但我們給每個(gè)人都使用相同劑量的抗體。”他表示，確定最有效的劑量尤為重要，因?yàn)檫@些藥物每劑的成本約為1萬(wàn)美元。

盡管檢查點(diǎn)抑制劑對(duì)20多種癌癥有效，并能治愈一些患者，但只有約20%的接受者能從中受益。羅森塔爾和他的同事們希望提高這一比例。他們之前使用熒光標(biāo)記抗體的研究表明，這些藥物往往無(wú)法在腫瘤中均勻分布。“有些區(qū)域藥物無(wú)法到達(dá)，”他說(shuō)道。今年，研究人員啟動(dòng)了一項(xiàng)臨床試驗(yàn)，以確定修改藥物劑量是否能使藥物分布更加均勻。參與者均為頭頸部癌癥患者，他們將接受不同劑量的檢查點(diǎn)抑制劑帕尼單抗以及一種改良版的熒光標(biāo)記抗體。在手術(shù)切除腫瘤后，羅森塔爾和他的同事們將測(cè)量樣本中的熒光強(qiáng)度，以確定帕尼單抗在癌組織中的滲透程度，從而推斷出最有效的劑量。羅森塔爾表示，如今患者接受的是他們所能承受的最高劑量，但這種藥物“可能在最大耐受劑量的二分之一或三分之一時(shí)就能發(fā)揮作用”，這可能會(huì)減少副作用并提高治療效果。

麥克德維特指出，庫(kù)恩斯性格靦腆，“對(duì)于自己的方法取得了如此廣泛的成功，他仍感到有些驚訝，甚至有些尷尬。”庫(kù)恩斯寫(xiě)道，他之所以能提出自己的標(biāo)志性想法，是因?yàn)樗隽舜罅康闹R(shí)儲(chǔ)備，并且有時(shí)間讓“潛意識(shí)發(fā)揮作用”。他寫(xiě)道，通往創(chuàng)造性突破的道路是“首先，用事實(shí)充實(shí)頭腦，并為之奮斗；然后是潛伏期；最后，突然領(lǐng)悟到解決方案。”

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青科沙龍第167期：琥珀酸促進(jìn)CD8+ T細(xì)胞干性及其抗腫瘤功能研究；馬凱麗（中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院蘇州系統(tǒng)醫(yī)學(xué)研究所副研究員）

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